RT-PCR試劑盒樣品制備操作步驟
瀏覽次數(shù):656發(fā)布日期:2021-07-09
本試劑盒是把RNA合成cDNA,然后再對(duì)此cDNA進(jìn)行擴(kuò)增的試劑盒。RNA的純度會(huì)影響cDNA的合成量,而制備RNA的關(guān)鍵是要抑制細(xì)胞中的RNA分解酶和防止所用器具及試劑中的RNA分解酶的污染。
因此,在實(shí)驗(yàn)中需要采取以下措施:戴一次性干凈手套;使用RNA操作專用實(shí)驗(yàn)臺(tái);在操作過(guò)程中避免講話等等。通過(guò)以上辦法可以防止實(shí)驗(yàn)者的汗液、唾液中的RNA分解酶的污染。
【使用器具】
盡量使用一次性塑料器皿,若用玻璃器皿,應(yīng)在使用前按下列方法進(jìn)行處理。
(1)用0.1%DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液在37℃下處理12小時(shí)。
(2)然后在120℃下高壓滅菌30分鐘以除去殘留的DEPC。
RNA實(shí)驗(yàn)用的器具和儀器建議專門使用,不要用于其它實(shí)驗(yàn)。
【試劑配制】
用于RNA實(shí)驗(yàn)的試劑,須使用干熱滅菌(180℃,60min.)或用上述方法進(jìn)行DEPC水處理滅菌后的玻璃容器盛裝(也可使用RNA實(shí)驗(yàn)用的一次性塑料容器),使用的無(wú)菌水須用0.1%的DEPC處理后進(jìn)行高溫高壓滅菌。
RT-PCR試劑盒實(shí)驗(yàn)用的試劑和無(wú)菌水都應(yīng)專用,避免混用后交叉污染。
【制備方法】
使用簡(jiǎn)單的RNA純化方法即可獲得滿足于RTPCR反應(yīng)的RNA(只需少量的RNA便可進(jìn)行RT-PCR反應(yīng))。但為了保證實(shí)驗(yàn)的成功率,建議使用GTC法(異硫氰酸肌法)制備的高純度RNA。
使用Catrim ox-14MRNA Isolation Kit Ver.2.11(TaKaRa CodeDWA005)可從血液中快速提取高純度的TotalRNA。
使用本試劑盒進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)時(shí),每次反應(yīng)所需的適量TotalRNA約為500ng。